三聚氰胺檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測奶粉、牛奶、組織、飼料、蛋類、血清等樣本中的三聚氰胺（Melamine，MEL），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣本溶液，樣本中的三聚氰胺和酶標板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含三聚氰胺含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中三聚氰胺的殘留量。
2 三聚氰胺檢測試劑盒技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：2ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測下限：
奶粉……………………………………40ppb
牛奶……………………………………54ppb
牛奶/奶粉（處理法二）………………2ppb
組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）………4ppb
飼料……………………………………200ppb
蛋類……………………………………40ppb
血清……………………………………8ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
三聚氰胺………………………………100%
三聚氰酸………………………………60%
三嗪、三嗪二銨………………………<1%
 2.5 樣本回收率：
牛奶、奶粉………………………90%±20%
組織………………………………85%±20%
飼料………………………………85%±20%
蛋類………………………………80%±20%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96孔
標準液：各1ml
0ppb、2ppb、6ppb、18ppb、54ppb、162ppb
高標準液（紅蓋）：1ppm…………1ml
酶標記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、正己烷、甲醇 
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：1M HCl 溶液
    取8.6ml濃HCl加去離子水至100ml。
配液2：乙腈-0.1M NaOH溶液 
    84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均勻。
配液3：0.1M NaOH 溶液
    稱取0.4g NaOH加去離子水至100ml。
配液4：1M NaOH 溶液
    稱取4g NaOH加去離子水至100ml。
配液5：復(fù)溶液
    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 牛奶樣本處理方法：
1）取牛奶樣本600µl到2ml的離心管中，加入1ml乙腈，充分振蕩混勻；4000r/min離心5min；
2）取100µl上清液，加入900µl復(fù)溶液，混勻；
3）取50 µl用于分析。
牛奶樣本稀釋倍數(shù)：27    檢測下限：54ppb
5.3.2 奶粉樣本處理方法：
1）稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中，加入4ml甲醇，充分振蕩；
2）4000r/min離心10min，取100µl上清液，再加入900µl復(fù)溶液，混勻；
3）取50µl用于分析。
奶粉樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：40ppb
5.3.3 牛奶/奶粉樣本處理方法二：
1）取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中；
2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取4ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至*干燥；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50µl用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：2ppb
5.3.4 組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）樣本處理方法：   
1）取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中；
2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取2ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至*干燥；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50µl用于分析。
     樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：4ppb
5.3.5 飼料樣本處理方法：
1）將飼料樣品研碎，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去離子水均質(zhì)；
2）旋流1min，放振蕩器上振蕩2min；
3）4000r/min離心15min，取出10ml上清液并用1M NaOH將pH值調(diào)至6-8。（注：因飼料樣品的不同，加入1M NaOH的量有所差異，根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）
4）4000r/min 離心15min，吸出上清液（如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）；
5）取上清液用復(fù)溶液10倍稀釋（取100µl上清液加入900µl復(fù)溶液，混合均勻）；
6）取50µl進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：100    檢測下限：200ppb
5.3.6 蛋類樣本處理方法：   
1）用均質(zhì)器低速均勻樣本（蛋清、蛋黃或全蛋）；
2）稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的樣本，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min；（蛋清含蛋白成份高，加入提取液后會形成一團膠狀物，較蛋黃或全蛋難搖勻，此情況為正?，F(xiàn)象不影響實驗結(jié)果）
3）4000r/min離心10min，取1ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至*干燥；  
4）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
5）取下層水相用復(fù)溶液4倍稀釋（50µl樣本液加150µl復(fù)溶液），混合30s；
6）取50µl用于分析。
 樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：40ppb
5.3.7 血清樣本處理方法：   
1）取0.5ml血清樣本于50ml離心管中；
2）加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取1ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至*干燥；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：8ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。