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ELISA檢測體系可謂是免疫學反響應用到科研生產(chǎn)中*為廣泛*為活絡的技術手段。但是在新老手操作過程中總是會出現(xiàn)或大或小的問題，本人在剛開始做ELISA時就面對許多困難，比如說花板，假陽性，全顯色，悉數(shù)顯色，顯色比空白還低,自己也為此苦惱過很長一段時間，跟著自己技術水平得進步，或多或少地也把握了ELISA體系的脾氣，也是游刃有余吧，現(xiàn)在做方陣，做ELISA已是駕輕就熟了，以前檢測一種抗體用整整一下午還算得暈暈的，現(xiàn)在給我十個八個的從包被到顯色，一個作業(yè)日根本搞定。下面就由上海基免生物為你說明一下，做ELISA的經(jīng)驗總結:
1、包被原的性質很重要，蛋白濃度，是否降解，這到你做出的抗體可不可以被其辨認，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴厲警告我必定要在冰浴下緩慢消融就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白，關于生物素和脂類物質或小分子物質咱們要事前對其改造再加以包被，我把辦法簡要的列出如下:①親和素生物素:先親和素先包被載體，參加生物素化的DNA，這種包被辦法均勻、結實，已擴展應用于各種抗原物質的定量測定。②脂類物質:可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后參加ELISA板孔中，開蓋置冰箱guo ye或涼風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質天然干固在固相外表。③小分子必須依托和大的蛋白載體偶聯(lián)后才干固定在固相載體上。
2、包被液的挑選，一般挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于實驗的需要，包被原的特殊性也可能選用中性的緩沖溶液來包。應留意以下原理：由于蛋白質與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體外表的疏水基團間的作用，這種物理吸附對錯特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質較小分子蛋白質一般含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體外表。詳細的實驗還要有鞏固的理論外也要實踐，看一下*終可不可以應用到自己實驗當中去。常用的包被液除了方才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、顯色:顯色體系又許多，咱們一開始做的時分，要挑選適合的顯色體系。留意顯色體系酶活性底物的保存HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉。
4、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好，如出現(xiàn)問題也好剖析。
5、關閉：繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。關閉就是讓很多不相關的蛋白質充填這些空地，從而排擠ELISA后的過程中攪擾物質的再吸附。常用關閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度運用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(首要為了掃除類似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但*終選用什么，要根據(jù)實驗詳細來實踐。
6、洗刷板：可以說在ELISA操作中，洗刷是*首要的關鍵技術。由于聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，為達到別離游離的和結合的酶符號物的意圖，清除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的攪擾物質，在洗刷時又應把這種非特異性吸附的攪擾物質洗刷下來。所以在洗板時會有必定差錯，人為因素很大(當然有條件的用洗板機在外)，洗的不*或串了孔，對如此活絡的ELISA體系但是不小的影響。
7、加抗體標本(和二抗):留意該換槍頭時換槍頭。標本稀釋一般可用pbs稀釋，也可用關閉液去稀釋。如需加二抗，還要留意二抗的作業(yè)濃度，太高浪費，太低則著色淺。